A型肉毒**對膝骨性關節炎大鼠模型鎮痛效果及機制的實驗研究（上）
馬文俊1 梁 英2，3
摘要
目的：評估A 型肉毒**(BTX-A)在骨性關節炎模型中的鎮痛效果及疼痛相關物質在脊神經節的變化，為其臨床**骨性關節炎疼痛提供科學的理論依據。
方法：SD 大鼠右膝關節腔內注射4%木瓜蛋白酶溶液0.3ml 建立膝骨性關節炎(KOA)的動物模型。造模成功的大鼠于第2 天隨機分為2 組：BTX-A 組(n=10)：關節腔內注射5μl BTX-A 0.1IU；WFI 組(n=10)：關節腔內注射5μl 注射用水；Sham 組(n=10)：非關節炎模型組。注射后第1、3、5 天后檢測疼痛行為學、熱痛閾，**組織化學檢測脊神經節鈉離子通道1.8(Nav1.8)蛋白的表達。
結果：自發疼痛行為分析顯示大鼠骨性關節炎引起步態異常，與WFI 組相比，BTX-A 組的大鼠異常步態改善明顯，注射后5 天與1、3 天相比較，自發疼痛行為改善的愈明顯；BTX-A 組大鼠右足熱痛閾升高(P<0.05)，脊神經節Nav1.8蛋白表達下調(P<0.05)。
結論：關節腔內注射BTX-A 可能通過下調脊神經節Nav1.8 蛋白的表達，減少**致敏，減輕關節疼痛，提高痛閾，從而起到鎮痛作用。
關鍵詞 A 型肉毒**；膝骨性關節炎；鈉離子通道1.8；熱痛閾；鎮痛
中圖分類號：R684 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1242(2017)-06-0649-05
DOI:10.3969/j.issn.1001-1242.2017.06.008
*基金項目：山西省課題基金（201301055）
1 山西醫科大學附屬**臨床醫學院，山西太原，030001；2 山西醫學科學院，山西大醫院；3 通訊作者作者簡介：馬文俊，男，碩士研究生，住院醫師；收稿日期：2015-04-06
膝骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是以滑膜和關節軟骨結構破壞為主要病理改變的慢性退行性的關節**[1]，發病率高，臨床表現為關節疼痛、活動受限，嚴重影響生存質量。目前**骨性關節炎的方法很多，如口服止痛劑、關節腔內注射皮質類固醇**或玻璃酸鈉、關節鏡清創術及關節置換，存在****反應[2]、效果持續時間不穩定，或高手術風險的代價[3]，因此急需**關節炎的**、有效的方法。
KOA 伴隨關節軟骨的損害及膝關節炎性介質的釋放增加，這些外周傷害性刺激的不斷的輸入將調控脊髓的痛覺傳遞神經元，通過痛覺過敏及**敏化機制，導致神經元突觸的興奮性增加和痛閾下降。脊神經節是疼痛信號傳導的**級神經元，且Nav l.8 特異性表達在脊神經節，激活其動作電位可使痛覺上傳。KOA 突出表現為關節疼痛，其疼痛的主要機制之一是脊髓中疼痛傳導遞質Nav l.8 的過度表達，使患者對疼痛的敏感度增高。研究表明，A 型肉毒**（botulinum toxix type A, BTX-A）對神經病理性疼痛具有較好的止痛作用，但對膝骨性關節炎的鎮痛效果和鎮痛機制，尤其脊髓水平鎮痛機制的研究尚缺乏相應的報道。目前已有臨床研究觀察到對老年慢性KOA 患者關節腔內注射A型肉毒**有減輕疼痛的作用，延緩KOA 的進展，但其鎮痛機制尚不明確，缺乏理論支持，故臨床應用受到制約。本研究擬在大鼠骨性關節炎模型中，通過關節腔注射A 型肉毒**，觀察其對大鼠膝骨性關節炎的鎮痛效果，并觀察脊髓背角中鈉離子通道Nav l.8 的表達的變化， 從**敏化角度部分闡明其鎮痛機制，達到改善膝骨性關節炎疼痛及**其**有效方法的目的。
1 材料與方法
1.1 材料
SD 大鼠，均為雄性，清潔級，體質量(150±30)g， 購自山西醫科大學動物實驗中心。木瓜蛋白酶，購自天津藥業集團新鄭股份有限公司，試劑號9001-73- 4。注射用BTX-A，購自蘭州生物制品研究所，批號20140609。兔抗大鼠 Nav1.8、FITC 標記山羊抗兔IgG 均購自太原市貝倍科貿有限公司；電動跑步機購自北京東西儀科技有限公司；鼠爪熱輻射刺激測痛儀購自北京智鼠多寶生物科技有限責任公司。
1.2 方法
參照Panicker 等[4]的建模方法建立實驗模型，固定大鼠使右膝關節屈曲90°，乙醇**并充分暴露，于臏韌帶外側0.2cm 凹陷處進針，出現落空感，回抽無血液后注入4%木瓜蛋白酶溶液0.3ml，注射完畢后再次**且反復活動膝關節。于第1、4、7 天分別進行注射。自注射之日起每日上、下午分別驅趕動物活動兩次，每次10min，以使大鼠于規定時限內運動不停歇為標準，連續7 日。
將SD 大鼠隨機分成3 組，每組10 只：其中兩組是骨性關節炎組，分別給予BTX-A 和WFI。BTX-A 組：用 30 號針頭穿刺 2.5mm，膝關節內注射 5μl 的 BTX-A 0.1 IU；WFI 組：膝關節內注射 5μl 注射用水；Sham 組為非關節炎大鼠。
1.3 檢測指標
1.3.1 行為學測試：自發疼痛行為步態分析：肉眼步態分析觀察大鼠在 17cm/s 的電動跑步機上行走20s。在0—4 分之間半定量分析大鼠的步態。0 分： 大鼠拒絕在跑步機上行走；1 分：大鼠行走了規定時間的30%，步態表現為嚴重的不協調；2 分：大鼠行走了規定時間的60%，步態表現為中等的不協調；3分：大鼠行走了規定時間的90%，期間沒有觸碰間隔物、跳躍、張腿或拖后腿，步態表現為輕微的不協調； 4 分：大鼠行走完了規定時間，期間沒有觸碰間隔物、跳躍、張腿或拖后腿。
熱刺激撤足閾值(paw withdrawal latency PWTL)的測定：利用鼠爪熱輻射刺激測痛儀檢測大鼠后肢足跟部皮膚對熱刺激的反應。測試前將大鼠放置于測痛儀的有機玻璃罩內自由活動約5min，測試時將熱輻射光源通過透明玻璃板輸出熱刺激并聚焦于大鼠后肢足掌部。調整好儀器刺激強度(IR= 72)，按下操作開始鍵，熱源啟動并緩慢施加熱刺激，在大鼠鼠爪撤足的瞬間手動記錄大鼠反應時間，此時間即為大鼠足底部的熱刺激撤足潛伏期(**度達0.1s)，即熱痛閾。為避免長時間熱刺激造成組織損傷不宜熱刺激時間超過25s。以5min 的間隔對雙側后足各測3 次，3 次撤足潛伏期的均值為所得數據。
1.3.2 **熒光組織化學檢測：用10%水合氯醛(4 ml／kg)麻醉大鼠后，行4%多聚甲醛經心臟灌流術固定，取出 L5 背根神經節，4%多聚甲醛浸泡固定 24h(4℃)。組織經乙醇梯度脫水，石蠟包埋，厚4μm 石蠟切片。切片晾干后，經二甲苯脫蠟，各級乙醇至水洗，PBS 溶液沖洗，脊神經節滴加Nav1.8 一抗后 4℃過夜；次日用 dH2O、磷酸鹽緩沖液(PBS) 各洗 5min，滴加羊抗兔FITC，室溫過夜(注意避光)，次日熒光顯微鏡觀察，在激發光波長為490nm、濾色光波長為520nm 條件下拍照。
1.4 統計學分析
全部數據應用SPSS 20.0 統計軟件進行處理， 行為學測試結果采用非參數秩和檢驗進行分析。同一組大鼠不同測試時間點的數據用相關樣本參數檢驗分析；采用均數±標準差表示計量資料，用t 檢驗及方差分析對計數資料進行分析，P<0.05 為有顯著性意義。
2 結果
2.1 膝骨性關節炎模型
在大鼠右膝關節內注射 4% 木瓜蛋白酶溶液0.3ml，實驗第5 天80%大鼠已有不同程度出現關節腫脹及活動受限，7d 達到高峰。取20 只自發疼痛行為步態分析陽性(評分為1 分）及關節腫脹的大鼠。
2.2 自發疼痛檢測結果
自發疼痛檢測陽性的20 只大鼠分為兩組，在右側膝關節內分別注射BTX-A 組(n=10)：5μl 的BTX- A0.1 IU，WFI 組(n=10)：5μl 的注射用水，分別在注射后1 天、3 天及5 天進行自發痛檢測。與WFI 組相比，BTX-A 組的大鼠自發疼痛行為改善明顯，差異有顯著性意義(P=0.002<0.05)。膝骨性關節炎大鼠在注射BTX-A 后1 天、3 天及5 天，分別進行自發疼痛步態分析的檢測。注射BTX-A 后時間不同，自發疼痛行為改善也不同，差異有顯著性意義（P< 0.05）。注射BTX-A 后1、3、5 天，三組中兩兩相比較均有顯著性差異（P<0.05），且隨著注射后時間延長 (≤5 天），自發疼痛步態改善越明顯。
2.3 熱痛閾檢測結果
2.3.1 三組大鼠：Sham 組、關節炎+WFI 組、關節炎+ BTX-A 組分別在注射后第1、3、5 天測試大鼠右足熱痛閾值。在實驗觀察的時間內，關節炎+WFI 組與Sham 組比較，PWTL 均有所降低（P<0.05，見表1)。
2.3.2 熱痛閾結果顯示：模型組大鼠第 1 天給予BTX-A 注射后24h 大鼠的熱痛閾值即明顯上升（P< 0.05，見圖1），且隨時間的延長其緩解疼痛效果逐漸明顯，一直可持續到注射后第5 天（P<0.05，見圖1），與注射用水組比較，BTX-A 組熱痛閾明顯高于對照組（P<0.05，見表1）。實驗結果表明注射BTX-A 可緩解疼痛，增加熱痛閾值。
2.4 脊神經節Nav1.8 的表達
**熒光組織化學結果顯示WFI 組可上調DRG（背根神經節）神經元中Nav1.8 蛋白表達水平（見圖2），與假手術組比較，有顯著性意義（P<0.05， 見表 2）。BTX- A 注射 5 d 后大鼠 DRG 神經元中Nav1.8 蛋白表達上調現象被明顯抑制（見圖2），與注射用水組比較，具有顯著性意義（P＜0.05，見表 2）。結果提示BTX-A 干預后可下調大鼠DRG 神經元中原本表達增多的Nav1.8 蛋白。
