改良型**性股骨頭壞死小鼠模型的建立與評價*

王繼濤 1，3 阮紅峰 1，2 付方達 1，3 吳承亮 1，2△

（1.浙江中醫藥大學**臨床醫學院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫藥大學骨傷研究所，浙江 杭州 310053；3.浙江省中醫院，浙江 杭州 310006）

中圖分類號：R285.5    文獻標志碼：A    文章編號：1004-745X（2017）09-1525-04 doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.007

【摘要】 目的 為建立有效的動物模型，更好研究**性股骨頭壞死的發病機制，科學闡明中**劑**該**的分子作用機制。 方法 取 45 只 2 月齡雄性 C57BL/6 小鼠隨機平均分為對照組、傳統組、改良組。  傳統組給予脂多糖聯合甲強龍**造模，  改良組小鼠則在傳統組基礎上調整飼料槽的高度，  迫使小鼠主動站立取食，并予跑步機上跑步 2 h/d；對照組給予等量的生理鹽水。 定時觀察小鼠一般狀況，分別于造模前、造模后第4 周、第 8 周抽血檢測血液中三酰甘油的含量，并于造模后 8 周測量小鼠股骨頭骨密度，次日處死取雙側股骨頭，體視顯微鏡下觀察股骨頭外觀及色澤。  采用蘇木精-伊紅染色法（HE）及阿爾新藍染色（ABH）等技術觀察小鼠股骨頭病理變化。 結果 傳統組和改良組小鼠精神狀態明顯差于對照組， 且改良組差于傳統組 （P < 0.05）；傳統組和改良組血液中三酰甘油的含量高于對照組，改良組高于傳統組；骨密度檢測顯示，傳統組和   改良組骨密度低于對照組，且改良組低于傳統組（P   <   0.05）；股骨頭形態學觀察發現改良組股骨頭軟骨下出血壞死的面積較傳統組嚴重，HE、ABH 結果顯示，傳統組有  9  只出現（空骨陷窩數量增多，骨小梁變細甚至斷裂）等骨壞死表現，造模成功率達 60%，改良組有  11  只出現（空骨陷窩數量增多，骨小梁變細甚至斷裂）股骨頭壞死的表現，造模成功率高達 73.3%（P < 0.05）。結論 傳統造模方法和改良造模方法皆可造模成功，但改良造模方法具有更高成模率。

【關鍵詞】 **性股骨頭壞死 動物模型 甲強龍 脂多糖 跑步機

股骨頭壞死（ONFH）是骨科臨床難題之一。 據流行病學報道， 在中國每年新增 50~75000 例股骨頭壞死患者［1］。 其中**性股骨頭壞死（SONFH）發病率占非創傷性股骨頭壞死的一半以上［2］。 SONFH 發病好發于青壯年，具有雙側高發病率的特點，且發病率逐年上升［3-4］；若不能進行及時有效地**，70%的患者*終將發生股骨頭塌陷， 給個人和社會帶來沉重的心理和經濟負擔［5］。 當前 SONFH 確切的發病機制和始動因素仍不明確， 因此建立一個全過程高度模擬人類早期SONFH 的動物模型顯得尤為迫切和重要。 本研究參照RyooS 等［6］的方法并加以改進，小劑量脂多糖聯合大劑量甲強龍誘導 C57BL/6 小鼠早期股骨頭缺血性壞死， 為研究早期 SONFH 的**和預防研究提供動物模型。 現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2 月齡 SPF 級雄性 C57 小鼠 45 只， 由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供， 動物許可證號：ACXK（滬）2015-0016。  實驗動物隨機平均分為 3組：傳統組（**加內**組）、改良組（在傳統組的基礎上進行站立取食聯合運動）以及對照組（僅予等量生理鹽水）。

1.2 試劑與儀器 大腸桿菌內** （Sigma 公司，美國批號 L2880， 規格 10 mg）； 甲潑尼龍琥珀酸鈉（ 甲強龍）（Pfizer Manufacturing Belgium NV 公司， 批號： A07056）；光學顯微鏡（Olympus 公司，日本），Milli-QS超純水器（美國 Millipore 公司），青霉素鈉（華北制藥股份有限公司， 批號：F3117217）；Sartorius BS110S 萬分之一電子天平（德國塞多利斯公司）；INSTRON 萬能材料試驗機（美國英斯特朗公司），小鼠跑步機（北京智鼠多寶公司），RM2235 石蠟切片機、LEICADM500 三目生物顯微鏡及圖像信號采集與分析系統（德國 Leica 公司）。

1.3   模型制備    傳統組小鼠腹腔注射脂多糖 20 μg/kg，每日 1 次，連續注射 2 d；第 3 天開始臀肌注射 100 mg/kg 的甲強龍，連續注射 2 周；第 3 周開始隔天注射** 1 次直至取材。 改良組在傳統組基礎上調整飼料高度迫使小鼠站立取食增加運動，并予跑步機跑步 2 h/d。 對照組不做任何處理， 并腹腔注射等量的生理鹽水。 所有動物每周臀部注射 3 萬 U 青霉素預防感染。 造模 8 周后取材（雙側股骨頭）。

1.4 檢測指標

1.4.1 動物一般體征  注射**后連續 8 周，  每日觀察各組動物注射后飲食、排便次數、皮毛光澤、體質量、精神狀態等情況。

1.4.2 小鼠血液學檢查  分別于造模前、   造模后第 4 周、第 8 周檢測血液中三酰甘油（TG）的含量。 取血方法：戳刺小鼠眼瞼，放血 1 滴，吸取血滴，置于 500 μL 的 EP 管中。

1.4.3 Micro-CT 檢測及骨密度分析 造模后 8 周，各組小鼠分批麻醉放在 Micro-CT 上掃描，對小鼠雙側股骨進行掃描。 通過相應分析軟件， 測得小鼠各組股骨頭骨密度。

1.4.4 形態學觀察 在無菌條件下，  用 0.02%的*鈉對小鼠（0.2 mL/10 g）進行腹腔注射，麻醉后將小鼠仰臥位固定于手術臺上， 逐層分離直至暴露髖關節，取出股骨頭。 用 1×PBS 清洗股骨頭，予體視顯微鏡下觀察雙側股骨頭外觀及色澤。

1.4.5 組織病理檢查 組織置于 4%多聚甲醛固定 3 d， 流水沖洗過夜，脫鈣 10 d 后，以針頭無阻力刺透為度。隨后進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、進行 HE、ABH 染色，光鏡下觀察股骨頭外形、軟骨、骨小梁、軟骨細胞的變化。

1.5 統計學處理 應用 SPSS12.0 統計軟件。  計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析。 P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1動物一般體征觀察 造模后，  定時觀察和比較 3 組小鼠的行為學差異，包括飲食、排便次數、皮毛光澤、體質量、精神狀態等。 脂多糖腹腔注射后，傳統組和改良組均出現不同程度的精神萎靡。注射**第 3 天后， 除對照組外，傳統組和改良組均出現大便稀溏，飲食和活動均減少的表現。 第 10 天后開始上述癥狀開始減輕，造模期間均未出現潰瘍，脫毛現象，改良組小鼠精神狀態較傳統組差。對照組與傳統組和改良組比較，對照組小鼠精神狀態正常，活動自如，飲食正常，皮毛光澤。 各組小鼠體質量變化見表 1。 由表可知，**具有能夠減輕小鼠體質量的作用，造模后 4、8 周，傳統組和改良組小鼠體質量較對照組明顯減輕（P ＜ 0.05），改良組與傳統組體質量差異無統計學意義（P > 0.05）。

2.2 各組小鼠各時間點 TG 比較 見表 2。 TG 水平在造模前、造模后第 4 周、8 周呈漸增趨勢， 第 4 周傳統組和改良組與對照組相比差異均有統計學意義（P ＜ 0.05），傳統組和改良組差異無統計學意義（P > 0.05）； 第 8 周時，傳統組和改良組差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）。

2.3各組小鼠各時間點股骨頭骨密度比較 見表 3。Micro-CT 顯示，**注射后股骨頭密度逐漸減少。 取材時發現改良組較傳統組、 對照組兩組更容易發生骨折，傳統組和改良組差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）。

2.4 各組小鼠股骨頭形態學觀察  見圖 1。  造模 8 周后，對照組股骨頭外觀明亮潔白，關節表面光滑；傳統組大部分小鼠股骨頭表面有小面積軟骨下出血壞死； 改良組大部分小鼠股骨頭軟骨下壞死的程度和范圍嚴 重，軟骨關節表面粗糙，出現囊性樣改變。

2.5 各組小鼠股骨頭組織病理學檢察 圖 2 為 HE 染色，背景為粉紅色，細胞核為藍紫色。 對照組小鼠股骨頭形態正常，骨小梁排列緊密，排列整齊。 傳統組 8周模型小鼠股骨頭外形圓滑，骨小梁排列紊亂，改良組8 周模型小鼠股骨頭，骨小梁排列不規則，骨髓腔細胞死亡、脫落。 圖 3 為 ABH 染色，背景為紅色，軟骨為藍色。 對照組小鼠股骨頭形態正常，軟骨表面光滑，軟骨基質含量較多，染色較深。傳統組小鼠股骨頭骺軟骨區厚度變薄，軟骨成分含量減少，染色變淺，骨小梁變細， 部分出現斷裂。 改良組小鼠股骨骺軟骨區厚度顯著變薄，骨小梁變細，部分斷裂甚至壞死，先前完整的骨骺線開始變得模糊，伴有纖維結構增生，甚至有骨橋形成。

3 討 論

臨床上， 許多**的**都需要長期服用大劑量**類**，例如腎病綜合征，支氣管**，SARS 等， 其帶來的并發癥股骨頭壞死也是很常見的。 SONFH 的患病人數也越來越多，但其發病機制尚不清楚，且缺乏切實有效的早期診斷和預防方法。 因此建立與人類SONFH 臨床病理特征相似的動物模型并探索其發病機制，尋求有效的**和預防方法就顯得尤為重要［7］。

SONFH 患者存在共同的病理特征，即在應用**前就已經有過敏性血管炎［8］。 內**使血管內皮發生損傷， 造成血液的流速減慢，血管內易凝血的狀態，在此基礎上大劑量應用**更符合臨床發病特征， 且有更好的成模率［9-10］。  因此，模型建立選擇**聯合內**。

理想的 SONFH 的動物模型應具有和人類高度相似的生理、病理、解剖特點， 能夠有效地模擬 SONFH 發展過程。 當前主要用兔和鼠用于 SONFH 造模。 選用小鼠作為實驗動物。小鼠是四肢動物，具有體質量輕的特點，雖然難以造成股骨頭塌陷的模型，但是小鼠作為實驗動物有著自身獨特的優勢。首先，小鼠的造模時間比較短，其次小鼠的活動空間大便于飼養，調整飼料槽的位置，使小鼠主動站立取食，模擬人股骨頭的受力狀態，有利于觀察**的發展過程。 更重要的是，小鼠與人體的基因具有高度的同源性，這種基因的同源性，使得小鼠生理生化與發育過程的指標與人體大致相似［11］， 從而對環境及**的反應也基本相同。 為此， 選用小鼠作為實驗動物。 常用的造模方法有：單純**、脂多糖聯合**、異體血清聯合**等方法［12-14］。 本課題組經過前期的預實驗，發現**用量在 20~100 mg/kg 的范圍內都屬于**用量，相關研究證實在**范圍內， **用量越大骨壞死發生率越高。 故采用的是脂多糖（20 mg/kg）聯合大劑量的**（100 mg/kg）同時配合站立取食聯合運動方法。 本模型具有兩方面優勢， 一方面迫使小鼠站立取食，能夠模擬人股骨頭受力［15］。另一方面，運動可以模擬人 SONFH 早期的日常生活狀態。造模 8 周，B 組 15 只小鼠中出現 9 只股骨頭壞死的表現，成模率達 60%；而 C 組 15 只小鼠出現 10 只股骨頭壞死的表現；成模率高達 73.3%，由此可見改良方法優于傳統造模方法。 造模過程中未出現小鼠死亡，這可能與無菌的操作習慣和良好的飼養環境有關。

本模型模擬 SONFH 的早期病變，具有以下優點： 1）模型誘導時間比較短，SONFH 效果明確；2）實驗動物存活率高，具有較好的成模率；3）與臨床上**性股骨頭壞死的發病十分相似；4）**聯合運動方法，能較好地模擬人發病早期的日常生活狀態。該模型建立，為早期**性股骨頭缺血性壞死研究提供了可靠的實驗 模型。

綜上所述， 脂多糖聯合甲強龍加站立喂食聯合運動方法能夠誘導小鼠早期**性股骨頭缺血性壞死的 發生，同時具有方法簡單、操作方便，成本低廉，成功率高的特點，有效地模擬 SONFH 早期的發病過程，所以該方法值得在股骨頭壞死的動物實驗中推廣應用。